Čovjek se oduvijek bavio genetikom, a da možda toga i nije bio svjestan. Izabirao je, selekcionirao, križao u biljnom i životinjskom svijetu, sve dok se to nije počelo događati i na području humanoga. Sva ljudska djelatnost, ona u okolišu i ona vezana neposredno uz čovjeka,
trebala bi imati kao cilj dobro i sreću svih ljudi. No, nijedna svrha, ma kako u sebi bila plemenita, primjerice, predvidiva korist za znanost, za druga ljudska bića ili za društvo, ne smije zanemaritiprvi moralno-etički kriterij, tj. poštivanje nepovredivosti ljudske osobe u njezinu tjelesno-duhovnom totalitetu i njezino dostojanstvo na svim njezinim razvojnim stupnjevima.Dostignuća moderne molekularne biologije i genetike omogućila su manipulacije s DNA na molekularnoj razini, ali i horizontalni prijenos gena i pripadajućih svojstava između jedinki različitih, nesrodnih vrsta te time stvaranje novih rekombinantnih svojstava živih organizama.
RAZVITAK MOLEKULARNE GENETIKE
Početna istraživanja i radovi na područiju genetičkog inženjerstva obavljali su se u razdoblju dvadesetak godina nakon otkrića građe i funkcioniranja nasljedne tvari. Watson-Crickov model DNA otvorio je novu stranicu u golemoj knjizi genetičke znanosti kao što je prije toga citogenetika dopunila prva znanja o nasljeđivanju stečena znamenitim Mendelovim pokusima. Genetika je tako ovim trećim stupnjem razvitka usla u najdublje i do tada najnedostupnije područije molekularnih struktura živih bića. Genetičko inženjerstvo nastavak je i praktična primjena molekularne genetike, pri čemu je riječ o umjetnoj izradbi, prerađivanju i prenošenju gena. Tako od 70-ih godina 20. stoljeća, najprije skromnim koracima, a zatim u sve širem zamahu, genetičko inženjerstvo zauzima neosporno sve važnije mjesto u sklopu primjenjene genetike. Ipak, pojavljivali su se povremeni zastoji i sumnje. Bilo je primjedaba i pitanja mogu li se zahvatima u gene narušiti neka ekološka, etička i moralna načela u biološkom razvoju i da li se to uopće „isplati“. Pojavile su se teorijske opasnosti od neplanskog i nekontroliranog manipuliranja genima. O tome se razvila opširna razmjena mišljenja među znanstvenicima svih struka, pa i pravnicima. No malo-pomalo prevladalo je gledište koje se može sažeti u primjedbi istraživača Paula Berga, graditelja prve hibridne molekule DNA, koji kaže: „Zaustavio bih te radove ako bi za to postojao čvrst praktični razlog, ali ne ako bi to bila samo etička presuda.“ No praktičnog razloga za zaustavljanje više nije bilo jer je sigurnost radova postajala sve bolja, a smjerovi znanstvenog napretka nisu se više mogli promjeniti. Molekularna genetika i genetičko inženjerstvo zadržali su svoje sasvim opravdano vrhunsko mjesto.
GENETIČKO INŽENJERSTVO
Ciljana tehnika obrade gena sasvim je nešto drugo nego prije spomenuta primjena induciranih mutacija pomoću mutagenih sredstava (radijacije, kemikalije i dr.). Kako znamo, vrste, količina i učestalost induciranih mutacija nisu unapriejd poznate, niti se može očekivati da bi to bile. Pritom je, dakle, sve više-manje nepoznato. Suprotno tome, posve određenim zahvatima u molekulsku građu DNA može se postići unaprijed smišljena promjena i prijenos gena.
Genetičko inženjerstvo predstavlja niz molekularno-genetičkih metoda uz pomoć kojih je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice. Genetičko inženjerstvo je skup biokemijskihpostupaka kojima se izrezuju cijeli geni, njihovi dijelovi ili skupine gena iz DNK jednog organizma i njihovo umetanje u unaprijed određeno mjesto u DNK drugog organizma. Otac genetičkog inženjeringa je austrijski biokemičar Erwin Chargaff.
Prvi korak u tom poslu jest stvaranje rekombinirane (hibridne) DNA. Da se to postigne, molekula DNA s genom nosiocem traženog svojstva izolira se iz davaoca i razreže (fragmentira) uz pomoć posebnog molekulskog „noža“ (to je enzim restrikcijska endonukleaza), da se dobije željeni odlomak s traženim genom.
Tako da možemo reći da razdoblje genetičkog inženjeringa počinje otkrićem restrikcijskih enzima, 70.-tih godina prošlog stoljeća i od tada postupci koji se primjenjuju u genetičkom inženjerstvu uglavnom su enzimski i molekularno-biološki te klasični postupci mikrobne genetike. 1978. dodijeljena je Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu W. Arberu, H. Smithu i D. Nathansu za njihov rad na otkriću restrikcijskih enzima.
Restrikcijski enzimi su enzimi koje bakterija koristi za razgradnju strane DNA (virusne). Enzim prepoznaje određenu nukleotidnu sekvencu (restrikcijsko mjesto) od 4 do 8 nukleotidnih parova, te cijepa na tom mjestu dvolančanu DNA.
Poznata su tri tipa restrikcijskih enzima: 1.prema vrsti sekvence koju prepoznaju,
2.prirodi cijepanja DNA i
3.strukturi enzima.
Restrikcijski enzimi dobivaju ime prema vrsti bakterije i soju iz kojega su izolirani; primjerice BamH1: Bacillus amyloliquefaciens soj H1.
Primalac, a to je najčešće neka bakterija koja se obilno množi, neće moći neposredno u svoj genom ugraditi strani gen i umnožavati ga. Zato se tehnologija rekombinantne DNA bazira na ugradnji stranog gena od posebnog interesa u genom prokariotske ili eukariotske stanice i to se radi uz pomoć plazmida ili bakteriofaga koje nazivamo vektorima.
Takav ćemo vektor razrezati istim restrikcijskim enzimom i slijepiti ga uz pomoć drugog enzima, ligaze, s odlomkom koji nosi izabrani gen. Tako je dobivena hibridna molekula DNA. Nju sada možemo prikladnim postupkom uklopiti u stanicu primaoca. Kako ta hibridna plazmidska molekula DNA ima također svojstvo replikacije, moći će se umnožavati u zantnim količinama, zajedno sa svojom stanicom domaćinom, te unutar te stanice sintetizira specifične produkte za koje nosi genetičku uputu. Stvaranje hibridnih molekula DNA temeljni je postupak u genetičkom inženjerstvu, a plazmide je za to prvi upotrijebio već spomenuti znanstvenik Berg. Dakako da su to složene biokemijske operacije, ali sasvim dostupne suvremenoj tehnici. Taj model hibridizacije primjenjen je najprije za proizvodnju hormona inzulina. Premda je izveden uz pomoć bakterija, on se pokazao vrlo upotrebljivim i može se primjeniti i kod eukariota. No, kako se vidi iz navedenog primjera, nastao je pri tome i sasvim novi tip bakterije. Spomenuta je opasnost upravo u tome da bi se mogli stvoriti i nepoćudni novi oblici mikroorganizama, pa i viših organizama.
Spomenimo još i to da se ovakvim postupcima može ne samo promjeniti sastav genoma nego se ugrađivanjem hibridnihmolekula u kromosome mogu promjeniti ili korigirati i pojedinačni geni.
U životinja se kao vektori najčešće koriste tumorski DNA virusi koji može transformirati normalne stanice miša, kunića i hrčka u tumorske stanice. Strana DNA može se ubaciti u eukariotsku stanicu metodom sličnoj bakterijskoj transformaciji. Taj se postupak naziva transfekcija. Eukariotski organizmi s ugrađenim stranim genima su transgenični organizmi.
Genetički inženjering koristi se u praksi od 1973. od otkrivanja DNA i stvaranja prve rekombinantne bakterije, odnosno postojeće bakterije E. coli koja je proizvodila gen salmonele. Na konferenciji u Asilmaru godine 1975. počelo se raspravljati o opasnostima povezanim s genetičkim inženjeringom, a glavni zaključak je bio da se korištenje ove tehnologije mora kontrolirati od strane države sve do trenutka kad će se sa sigurnosti znati da je bezopasna.
Herbert Boyer je osnovao prvu poduzeće, koje je koristilo tehnologiju rekombinirane DNA pod imenom Genetech i 1978. proizveli su vrstu E. coli koja je proizvodila ljudski protein inzulin. Ovo je mnogo pomoglo oboljelima od dijabetesa.
Godine 1986. prva probna testiranja bakterija koje su genetski promijenjene da zaštite biljke od leda izvršila je mala tvrtka Advanced Genetic Sciences iz Oaklanda, Kalifornija. Iste godina počeo je s terenskim istraživanjima Monsanto.
Krajem 1980-tih počeo se uzgajati manji broj eksperimentalnih usjeva s genetski modificiranim (GM) biljkama u Kanadi i SAD-u. Po prvi put su komercijalno korišteni polovicom devedesetih godina dvadesetog stoljeća. Od toga vremena koriste se sve više i više.
Komercijalni razvoj genetskih modifikacija kroz povijest: 1983.g. uzgojem genetski modificiranog duhana koji je otporan na antibiotik, 1985.g. prve genetski modificirane biljke otporne na insekte, viruse i bakterije uzgajane ex vitro, 1990.g. prvi uspješni ex vitro uzgoj (genetski modificirani pamuk), 1994.g. Flavr – Savr rajčica prva genetski modificiran hrana odobrena od strane FDA , 1995.g. komercijalizirane biljke rezistentne na herbicide i insekte, 1997.g. genetski modificiran kukuruz odobren od strane Europske unije.
KLONIRANJE
Klon je populacija stanica ili organizama koji su genetički identični, a nastali su binarnom diobom (bakterije) ili mitozom iz jedne stanice ili vegetativnim razmnožavanjem zajedničkog pretka. Nespolno razmnožavanje u prirodi je zapravo kloniranje.
Mnogobrojni su primjeri kloniranja u prirodi: u npr. prokarioti, praživotinje, jednostanične alge, biljke, čovjek: monozigotni, jednojajčani blizanci..
Poznato je da se klonovi mogu dobiti uzgojem vegetativnih sadnica raznovrsnih biljaka. No umjetno se mogu uzgojiti i kulturom iz jedne stanice ili skupine istovrsnih stanica, tj. na staničnoj razini. to se može korisno primjeniti u raznim granama bioproizvodnje: u ratarstvu, šumarstvu, voćarstvu, povrtlarstvu, itd. ali i kod zivotinjskih i ljudskih stanica. U nekim institucijama kloniraju se tako, na primjer, tumorske stanice za istraživačke svrhe. Vegetativno razmnožavanje u biljaka je razmnožavanje pomoću vegetativnih organa koji se odvajaju od roditeljske biljke i iz njih se razvije nova biljka. Vegetativno razmnožavanje povezano je s diobama meristemskih stanica i mogućnošću neograničenog rasta.
Prvo kloniranje na razini gena izveli su Boyer i Cohen 1973. godine s plazmidima crijevne bakterije, koji su poznati kao vektori u hibridizaciji DNA i usporedno aktivni u njezinu daljnjem umnažanju. Postupak je već opisan u prijašnjem prikazu o hibridizaciji DNA, a temelj je najsuvremenijeg genetičkog inženjerstva.
Posebni načini nespolnog razmnožavanja su apomiksija i partenogeneza. APOMIKSIJA je razvitak sjemenke bez oplodnje, a sjemenka se može razviti iz neoplođene jajne stanice ili iz bilo kojeg diploidnog dijela tučka (maslačak). PARTENOGENEZA je razvoj embrija iz neoplođene jajne stanice; javlja se u nekih zadružnih kukaca (trutovi).
Neke životinjske vrste razmnožavaju se partenogenezom samo u nepovoljnim životnim uvjetima, dok se druge isključivo razmnožavaju partenogenezom, pa su sve jedinke ženskog spola – pri tome se nakon mejoze udvostručuje broj kromosoma u jajnoj stanici koja se razvije u zigotu (neke vrste guštera, moljci, oblići itd.).
KLONIRANJE BILJAKA
Proces kloniranja počinje odabirom biljaka čiji se genski duplikat želi stvoriti. Biljke izlažu temperaturama iznad 30oC , peru se u mješavini alkohola kako bi se s njihove površine uklonila sva nečistoća i virusi. Sa vrha matične biljke uzimamo komadiće tkiva i uvodimo ih u pripremljene uzgojne podloge. Te uzgojne podloge posebno se pripremaju za svaku vrstu biljke koja se klonira jer eksplantat nema korjene i ne može vršiti fotosintezu pa ga zato u prvoj fazi kloniranja hranimo šećerom. Nakon mjesec dana razvoja na hranjivoj podlozi i pod strogo kontroliranim uslovima svijetla i temperature,eksplantat je dovoljno razvijen za prvu hormonsku terapiju, kojom se potiče rast bočnih izboja biljke. Ti vrhovi koriste se za umnožavanje biljaka jer od jednog eksplantata skinutog s matične stabljike nasađivanjem na podlogu dobija se desetak genski potpuno identičnih biljaka. U hranjivu se podlogu dodaju hormoni za poticanje rasta korijena kako bi klonirane biljke mogle samostalno crpiti hranu iz zemlje kada budu poslane u proizvodnju. Tada se klonirane biljke s izraslim korenom prenose u komore za očvršćivanje, u kojima im se uskraćuje šećer kako bi se privikle na uslove u prirodnoj sredini.
Kloniranje biljaka u laboratorijskim uvijetima
Tehnikama kulture biljnih stanica i tkiva u uvjetima in vitro (uzgoj u staklenim posudama) mnoge biljne vrste mogu se klonirati u laboratoriju. U sterilnim i strogo kontroliranim uvjetima moguće je iz malih dijelova biljke ili čak iz pojedinih biljnih stanica uzgojiti čitavu biljku. Za prvi pokušaj regeneracije mrkve iz diferenciranog tkiva korijena zaslužan je F.C. Steward 1952. Takve se regenerirane biljčice mogu iz epruvete prenijeti u zemlju. Na taj se način neka majčinska biljka može klonirati u veliki broj genetički identičnih potomaka.
Stewardov pokušaj regeneracije mrkve iz jedne diferencirane stanice je dokaz totipotentnosti biljne stanice. Totipotentnost je zadržavanje embriogenog potencijala diferencirane stanice.
Kod biljaka proces kloniranja je mnogo lakši zato što su mnogi tipovi stanica sposobni da regeneriraju čitavu novu biljku, sve biljke poseduju mogućnost prirodnog kloniranja.
KLONIRANJE ŽIVOTINJA
Umjetno kloniranje provedeno je i kod životinjskih jedinki. Totipotentnost je puno teže pokazati u životinja.Pokusi na vodozemcima pokazali su da sposobnost razvoja novog organizma prvenstveno ovisi o fazi razvoja stanica koje se koriste kao donori diploidne jezgre. Ako je donor jezgre nediferencirana stanica embrija iz većine će se jajnih stanica s transplantiranom jezgrom razviti punoglavci. Ukoliko se koriste diferencirane stanice punoglavca (npr. stanice crijeva) u manje od 2% slučajeva će doći do razvoja punoglavca. Jezgre stanica rane embrionalne faze razvitka još uvijek su totipotentne, dok je to rijetkost u već diferenciranih stanica. Iako diferencirane stanice imaju identičan genetički materijal kao i embrionalne, očito je da su neki geni nepovratno inaktivirani, te je potrebno poznavati uvjete pod kojima bi se aktivnost gena vratila. Tako je istraživač Gordon proizveo klon potpuno jednakih žaba tako da je presadio više jezgara iz stanica žabljeg zametka u jaja kojima su bile izvađene jezgre i pustio da se iz njih razviju žabe. One su bile potpuno jednake.
Na sličan način dobivene su i klonirane ovce, majmuni, a to je vrlo blizu opasnom kloniranju čovjeka.
No kloniranje jedinki može se provesti i odjeljivanjem prvih embrionalnih stanica jedne od druge i uzgojem svake posebno (kao što u prirodi nastaju jednojajčani blizanci).
GENETIČKO INŽENJERSTVO U PRIMJENI
Kloniranjem gena genetičko je inženjerstvo dospjelo u fazu kada može unaprijediti mnoge korisne postupke u našoj životnoj svakodnevnici, ali i upasti u problematične zahvate u prirodnu evoluciju i održanje života uopće. Korisne primjene kloniranja su mnogobrojne, ali možemo spomenuti smao neke od njih.
Već znamo da je jedan od prvih takvih uspjelih postupaka bio prijenos i kloniranje gena koji kodira proizvodnju hormona inzulina. Inzulin regulira stanje šećera u organizmu i njegov nedostatak razlog je šećerne bolesti od koje boluje veliki dio pučanstva u svijetu. No taj se hormon tehnički dobiva u nedostatnim količinama iz životinjskih žlijezda gušterača. Ako se gen za inzulin prenese u bakteriju koja se obilno i brzo množi, bit će i taj gen umnožen, kao i protein čija je struktura upisana u taj gen. Time je moguća znatno veća proizvodnja hormona. Sličan je uspjeh postignut i s hormonom rasta.
Kao daljni primjer može se navesti da je rekombinacijom gena i kloniranjem moguće proizvesti tkz. transgenske životinje. Tako je unošenjem čovječjega gena za hormon rata u zametak miša dobiven „supermiš“ mnogo veći od uobičajnoga. Bilo je takvih pokušaja i sa svinjama, ali s manje uspijeha. Ipak su se promjenila neka tkiva, osobito se razvilo više mišićnog, a manje masnog tkiva. Prijeti, međutim, opasnost takvih pokušaja s ljudima, sto je glavni poticaj nastojanjima da se pokusi kloniranja uopće zabrane.
Primjenom kloniranja može se pronaći broj i redosljed dušičnih baza nekog gena. Godine 1980. Sagner i Gilbert dobili su Nobelovu nagradu za otkriće tog postupka. Sagner je već prije uspio odrediti građu molekule DNA iz čovječjeg mitohondrija, koja sadrži 16 569 parova dušičnih baza, a on i Gilbert su radom tijekom četiri godine odredili redosljed 172 000 dušičnih baza DNA jednog virusa. Ako se uzme u obzit da čovječji genom sadrži po najozbiljnijim procjenama oko 6 milijardi baza, vidimo koliki bi rad bio potreban da se to istraži. Dosadašnji uspjesi bili su mogući samo uz pomoć kloniranja i kompjuterske tehnike.
Genskim manipulacijama može se tako odrediti ne samo raspored i broj dušičnih baza DNA nego i sasvim točan lokus gena u kromosomu.
Mogli bi se također mjenjati geni kod ljudskih genetičkih bolesti. Pokušava se provesti kloniranje gena koji upravljaju sintezom bjelančevina za zgrušavanje krvi, što bi sprečavalo oboljenje osoba ugroženih od hemofilije. Prijenosom gena i monoklonskom kulturom uspjelo je u novije doba proizvesti i enke prirodne obranbene tvari potrebne čovječjem organizmu za suzbijanje bolesti.
Kloniranje može imati još mnogo primjena. Bakterijskim plazmidima mogu se prenjeti geni za otpornost biljaka protiv pesticida. Pomoću gena iz dušičnih bakterija moglo bi se biljkama dati mogućnost za sintezu dušičnih spojeva iz atmosferskog dušika. Zanimljivi mogu biti i klonovi bakterija koje prerađuju pojedine organske i anorganske spojeve, pročišćuju minerale, uništavaju otpatke itd.
ZNAČENJE MIKROORGANIZAMA U GENETSKOJ TEHNOLOGIJI
U prethodnom tekstu smo saznali da golemo značenje i ulogu u svim genetičkim istraživanjima, a posebno za rekombinaciju i kloniranje gena, imaju bakterije, virusi, bakteriofagi, njihovi plazmidi, kromosomi i dijelovi njihovih DNA ili RNA. Teorija šifre, sustav genetičkog koda, prijenos (transdukcija) gena i mnoga druga otkrića učinjena su pomoću tih malih životnih oblika ili na njima. Ako se još uzme u obzir proučavanje i rješavanje genetskih problema uz pomoć kvaščevih i ostalih gljivica, pa i nekih praživotinja, možemo reći da je danas primjena mikroorganizama za čitavu genetiku, a posebno za genetičko inženjerstvo, nezamjenljiva. Dok je Mendel svoje prve genetičke pokuse obavljao na grašku, a Morgan i njegovi suradnici na vinskoj mušici, današnja se genetika osobito rado služi mikroorganizmima zbog nekoliko razloga:
1. Mikroorganizmi se lako i brzo uzgajaju na hranjivim podlogama,
2. Na njihovim se kulturama dobro zamjećuju razni vanjski utjecaji,
3. Za vrlo kratko vrijeme stvaraju se brojne generacije s golemom masom potomaka.
Tako se kod njih rezultati križanja, mutacija, kloniranja i ostalih genetičkih zahvata mogu vrlo brzo vidjeti.
GENETIČKO INŽENJERSTVO I BIOLOŠKA EVOLUCIJA
Mnogobrojni utjecaji mogu upravljati sudbinom naslijeđa organskih vrsta. Pojedinačna i grupna varijabilnost, razlike među jedinkama i populacijama početni su koraci evolucije. Kako će taj proces teći, hoće li se gomilate štetne ili korisne promjene, ovisi o mnogim slučajnostima. Genetička znanost može mnogo toga predvidjeti, a primjenom suvremenih bioloških i kemijskih metoda donekle i upravljati tim procesima.
Doba visoko civilizacije, a posebno današnje atomsko doba, nosi uza sve prednosti i mnoge opasnosti koje se odnose na samo održanje čovjeka i prirode. Na jednom je od prvih mjesta i genetička opasnost.
Uoptreba kemijskih sredstava sve je veća u prehrani i liječenju čovjeka, u industrijskoj proizvodnji, uzgoju korisnog bilja i uništavanju štetnika. Uza sve koristi to znači i sve bliži doticaj s tvarima koje mogu prouzročiti mutacije ili trajne modifikacije. Nepravilnom primjenom tih sredstava nastaje genetička otpornost bakterija na antibiotike i kukaca na insekticide. To stvara stalno nove probleme u suzbijanju bolesti. Djelovanje nekih kemikalija može imati negativne posljedice i za genetičke osobine čovjeka.
Posebno su genetički opasne posljedice radijacije. Energija radijacija može proizvesti nepoželjne promjene u kemijskom sastavu gena. Većina mutacija koje mogu nastati zračenjem opasne su za čovjeka. Neplodnost i nasljedne deformacije u vezi s atomskim zračenjem nastaju zbog mutacija u gametama. Budući da su genske mutacije obično recesivneto se defekti mogu pojaviti tek u F2 generaciji, što je žalosna perspektiva za potomke.
Radijaciski efekti ne moraju proizilaziti izravno iz eksplozija ili atomskih raktora. Djelovanje se može pokazati i kasnije putem radioaktivnih izotopa (stroncij 90, kobalt 60 itd.) koji su se nagomilali u vodi i hrani, u moru i u tlu od prijašnjih atomskih pokusa ili radioaktivnih otpadaka. Zbog toga je potreban neprestan nadzor industrijske atomistike, a poštovanja je vrijedna svaka borba protiv atomskog oružja. Riječ biologa, a posebno genetičara, treba u novim odnosima tehničkog napretka poslužiti za dobro naroda i čovjeka uopće.
Možemo se pritom zapitati: Kakva može biti općenita uloga genetičkog inženjerstva u sklopu tih odnosa?
Uzevši u obzir sve što nam je poznato o genetičkom inženjerstvu, sigurno je da se nasljedna tvar i na razini molekularne građe može lakše mjenjati nego što se prije mislilo. O pozitivnim mogućnostima tih promjena saznali smo iz nekoliko prethodnih članaka ovog teksta. Preostaje samo još pitanje što je s mogućim negativnim izgledima umjetnog zahvaćanja u genske strukture. Opasnosti od genetičkog inženjerstva i kloniranja bi se pojavili samo kada bi se primjenjivali posve neplanski, nekontrolirano ili čak sa zlim namjerama. Mogle bi se pojaviti nove vrste patogenih bakterija, nove bolesti ili pak monstrumi organizama. No vjerujući u pozitivne vrijednosti znanstvenog napretka, suglasimo se s riječima nobelovaca Wilkinsa da genetičko inženjerstvo može kao i prijašnja genetička istraživanja donjeti razumnom čovječanstvu jedino neprocjenjive koristi.
Što se pak tiče potrebe poznavanja tih problema, nije loše citirati misao poznatog znanstvenika Westheimera, koji kaže: „Može li se danas smatrati dovoljno naobraženim itko tko ne zna barem malo o molekularnoj biologiji“, a s time, dakako, i o molekularnoj genetici.
Nema komentara:
Objavi komentar